V muzeu Smithsonian institut ve Washingtonu nastala noc. Strážci odešli domů, světla zhasla, dětští návštěvníci jsou doma ve svých postelích... přesto je v "prázdném" muzeu podivný šramot. Bývalý noční hlídač Larry Daley (Ben Stiller) je opět zatažen do těžko představitelného dobrodružství, ve kterém ožívá sama historie.
Příběh začíná ve chvíli, kdy Larry opustil bídně placenou práci hlídače v muzeu, a stal se žádaným vynálezcem. Zdá se, že má konečně vše, po čem touží, přesto mu v životě něco schází. Cosi jej táhne zpět do muzea, tam kde to měl rád, kde kdysi zažil neopakovatelnou magickou noc.
Larry netuší, že mezi tím jsou jeho nejoblíbenější exponáty (a zároveň jeho nejlepší kamarádi) už považovány za zastaralé. A tak zabaleny v bednách čekají na odvoz do ohromných depozitářů v největším muzeu na světě, v muzeu Smithsonian ve Washingtonu. Jejich další osud je tak náhle velmi nejistý - tedy jen do chvíle než jeden z nich, miniaturní kovboj Jedediah (Owen Wilson), zavolá Larrymu a popíše mu hrozící katastrofu.
Egyptský vládce Kahmunrah (Hank Azaria) je po třech tisíciletích spánku v prachmizerné náladě. S trojicí nejnenáviděnějších přisluhovačů světa, jmenovitě carem Ivanem Hrozným (Christopher Guest), císařem a vojevůdcem Napoleonem Bonaparte (Alain Chabat) a mafiánem Al Caponem (Jon Bernthal) zmobilizují všechny své přívržence a plánují převrat, při kterém ovládnou nejdříve muzeum Smithsonian a pak rovnou i celý svět.
Rozhněvaný Larry rychle přijíždí do Washingtonu. Při své záchranné misi potká několik výjimečných nových přátel: excelentního Alberta Einsteina, čestného Abrahama Lincolna i naprosto okouzlující exponát - nezkrotnou Amelii Earhartovou (Amy Adams), jež v Larrym probudí jeho ztracený smysl pro dobrodružství a zábavu. Po boku se starými kamarády jako jsou Teddy Roosevelt (Robin Williams), Octavius (Steve Coogan), Sacajawea (Mizuo Peck), Attila Hun (Patrick Gallagher) a neandrtálci se Larry nezastaví před ničím, a dříve než se rozední, nastolí v muzeu pořádek.
Noc v muzeu 2 je historicky první film, který byl natáčený v komplexu muzea Smithsonian - největším a nejnavštěvovanějším muzeu světa.